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Les nombreuses recherches réalisées ces dernières années sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui conduisent à la néphrotoxicité des aminoglycosides ont permis, en 1989, de proposer l’hypothèse suivante : les aminoglyccosides, en seliant aux phospholipides acides inclus dans les liposomes, diminueraient la charge négative portée par les bicouches lipidiques indispensable à l’activité optimale des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine
Cette hypothèse simple a cependant dû être modulée suite aux résultats de travaux ultérieurs sur l’effet de la nature du phospholipide acide inclus dans la bicouche sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et leur inhibition par les aminoglycosides. En affet, l’hydrolyse de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipide acide de l’acide phosphatidique, de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Par ailleurs, alors que par filtration sur gel (Wagner, 1987) ou par équilibre de dialyse (Piret, 1989), les paramètres de liaison (Kd et Bmax) de la gentamicine à des liposomes chargés négativement apparaissent semblables quelque soit la nature du phospholipide acide inclus dans les bicouches, la gentamicine exerce un effet inhibiteur nettement moindre sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine lorsque les liposomes contiennent de l’acide phosphatidique plutôt que de la phosphatidylsérine ou plus encore du phosphatidylinositol.
Ces résultats suggèrent d’une part, que l’activité des phosholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine est fonction de la nature du phospholipide acide inclus dans des liposomes et d’autre part qu’il n’y a pas de relation absolue et/ou directe entre la capacité de la gentamicine à se lier aux bicouches chargées négativement et l’effet inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Ce dernier effet est d’ailleurs fonction, semble-t-il, d’autres paramètres comme l’accessibilité à l’eau de l’antibiotique inclus dans la bicouche lipidique.
Grâce à la technique de partition entre deux polymères en phase aqueuse des différents types de liposomes préparés nous avons pu réaliser ce premier objectif et montrer qu’il n’existait pas nécessairement de relation absolue et/ou directe entre la charge négative portée par la bicouche lipidique et l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine. En effet, la charge portée par la couche externe des liposomes semble moins importante lorsque le phospholipide acide inclus dans la bicouche lipidique est l’acide phosphatidylinositol et ce, quelque soit le pourcentage dephospholipide acide présent. Par contre, l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipides acides de l’acide phosphatidique ou de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Selon ces résultats, l’activité des phospholipases lysosomiales serait donc inversement proportionnelle à la quantité de charges négatives portées par les bicouches. Néanmoins, avant de tirer une conclusion aussi hâtive, il faut noter que nos données sont en contradiction avec celles rapportées dans la littérature. En effet, il est connu que les phospholipides se répartissent de façon asymétrique entre la face interne et externe de la bicouche. L’acide phosphatidique, par exemple, serait localisé du côté externe de la membre, ce qui en accord avec le haut pouvoir fusogénique de ce phospholipide (Bondeson et. al, 1984). Par contre, la phosphatidylsérine serait localisée dans la monocouche interne des membranes cellulaires (op den kamp, 1979; Quist de Barker, 1983).
Par ailleurs, les résultats de Jocelyne Piret (1989) ont montré que les paramètres de liaison décrivant l’interaction qui s’établit entre la gentamicine et les liposomes contenant les différents phospholipides acides ne présentent pas de différences importantes selon la nature du phospholipide chargé négativement considéré. Ceci suggérant l’absence de différence de répartition des liposomes chargés négativement par les différents phospholipides acides envisagés distribués entre le feuillet interne et externe. Enfin, il faut mentionner que les résultats de partition de liposomes chargés négativement entre deux polymères en phase aqueuse, s’ils se traduisent bien, pour un phospholipide acide donné, la quantité de ce phospholipide présent semble influencer par la nature de ce dernier.
Si l’on ne comprend pas encore parfaitement l’influence de la nature d’un phospholipideacide inclus dans les liposomes sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et de leur inhibition par les aminoglycosides, nous avons voulu dans un second temps, tester l’influence de la présence d’un ganglioside comme lipide chargé négativement.
Les résultats obtenus montrent que la présence d’une charge négative n’est pas, en soi, un facteur suffisant pour augmenter l’activité des phospholipases lysosomiales via-à-vis de la phosphatidylcholine. De plus, nos travaux montrent, pour la première fois à notre connaissance, que les aminoglycosides peuvent se lier aux membranes qui contiennent des gangliosides. Cette liaison de la gentamicine aux liposomes contenant des gangliosides pourrait expliquer le pouvoir inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Par ailleurs, le pouvoir inhibiteur de la gentamicine est fonction de la nature du lipide acide inclus dans les liposomes.
Les aminoglycosides inhibent l’activité des enzymes lysosomiaux impliqués dans le catabolisme des phospholipides, c’est-à-dire les phospholipases A et C (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983 ; Scwertz et. al, 1984 ; Lambricht et. al, 1986) et la syngomyélinase (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983) provoquant ainsi l’accumulation de lipides comme la phosphatidylcholine, le phosphatidylinositol, la sphingomyéline. Vu le rôle important joué par les gangliosides dans plusieurs fonctions biologiques comme la communication intercellulaire, les réponses immunitaires, la régulation de la croissance et de la différenciation cellulaire, l’oncogénèse et modulation de signaux transmembranaires (Hakomori, 1981, 1986 ; Nudelman et. al, 1983 ; Weegant, 1985 ; Chan, 1987 ; Tsuji et. al, 1985), nous voudrions tester l’effet des aminoglycosides sur la dégradation des gangliosides car l’inhibition éventuelle de la ganglioside II³ Neu Ac-Gg4 Cer galactosidase ou un effet des aminoglycosides sur le cofacteur protéique nécessaire à l’hydrolyse du Gm1 pourraient avoir des conséquences importantes sur le fonctionnement cellulaire. A ce sujet, des études récentes ont apporté des résultats intéressants : d’une part Aslam et. al (1988) ont montré que l’administration de gentamicine à des rats (135 mg/kg de poids sec/jour) pendant vingt et un jour augmente de façon importante la quantité de gangliosides dans certaines parties du cerveau (la jonction et le colliculus inférieur). D’autre part, Kishore et. Al (1988) rappotent que la gentamicine ou la nétilmicine (10mg/(kg.jour) pendant 4 à 10 jours) augmentent le contenu du cortex rénal des rats traités en acide sialique qui est lié aux lipides et aux protéines. Ces observations pourraient résulter d’une perturbation dans le métabolisme des glycosides (et des glycoprotéines).
Par ailleurs, vu effet important de la nature du lipide chargé négativement présent aux environs du substrat sur l’activité des phospholipases lysosomiales et leur inhibition par les aminoglycosides, nous aimerions tester, dans les mêmes conditions, l’effet des sulfatides. Au préalable, nous essayerons de caractériser la distribution des sulfatides au sein des membranes biologiques car ces lipides, tout comme les gangliosides, sont connus pour former des domaines.
De plus, nous essayerons de mieux comprendre certains des résultats obtenus dans ce travail en étudiant par exemple l’asymétrie de distribution des phospholipides acides dans les membranes par résonance magnétique nucléaire et la formation de domaines de gangliosides par calorimètrie différentielle

Medical Laboratory Science --- Aminoglycosides --- Phospholipases --- Liposomes

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Gentamicin is an aminoglucoside antibiotic used in clinics to cure severe infections due to Gram negative bacteria. After glomerular filtration, gentamicin is reabsorbed by endocytosis in the proximal tubular cells and accumulates principally inside lysosomes ( De Broe and al., 1984; Silverblatt et al., 1978; Tulkens et al;, 1978). At a therapeutic dose, gentamicin induces apoptosis in vivo in rat kidney (El Mouedden and al., 2000a). This process can be reproduced in cultured cells (LLC-PK1, MDCK) (El Mouedden and al., 2000b) and Servais et al have characterized the mechanism involved. They showed on LLC-PK1 cells that’s gentamicin induces a destabilization of the lysosomal membrane detected after 2 hours, a drop of the mitochondrial membrane potential after 10 hours, and an activation of caspace-3 in parallel with nuclear fragmentation after 24 hours (Servais and al., submitted).
In the present work, we tried to understand the cellular mechanisms involved in apoptosis induced by gentamicin 2mM and especially the roles of the lysosomes mitochondria.
The perméabilisation of the lysosomal membrane induced by gentamicin could be responsible for the release of lysosomal proteases which could be able in turn to part recruitment and activation of Bcl-2 prtoein family (like Bax) and to activate the mitochondrial pathway and release of cytochrome c e.g.
By western blot and RT-PCR, we showed an increase of Bax protein in the cells rtreated for 8 hours with 2mM gentamicin but, we did not notice any difference at the level of mRNA
Then, by cellular fractionation and western blot, we evidenced a translocation of Bax from cytosol to mitochondri. In parallel, cytochrome c underwent a translocation from mitochondri to cytosol. Lastly, using western blot, we observed a delocalisation of cathepsin D (a lysosomal protease that could be able to activate Bax) from MLP fraction to thee nuclear fraction and the cytosol and by DAPI technic we showed a decrease of the number of apoptosis cells if cells are pretreated with pepstatinA, an inhibitor of cathepsin D.
By these observations, we suggest that apoptsis induced by gentamicin in LLc-PK cells could be initiated by a permeabilisation of the lysosomal membranes after 2 hours, involving a release of proteases (including cathepsin D) and gentamicin which would be responsible for activation of mitochondria and release of cytochrom c from mitochondria to cytosol Résumé : La gentamicine, un antibiotique de la famille des aminoglycides, est utilisé en clinique pour traiter des infections sévères à bactéries Gram négatif. A dose thérapeutiques, la gentamicine induit de l’apoptose in vivo dans les reins de rats traités (el Mouedden et al., 2000a.). Ce processus a pu être reproduit sur plusieurs types cellulaires dont les fibroblastes d’embryons de rats et des cellules rénales de type LLC-PK1 et MDCK (El Mouedden et al, 2000b).Des travaux récents ont montré que, sur des cellules de type LLC-PK1, la gentamicine induit une perméabilité de la membrane lysosomiale détectée après 2 heurs. Cette perméabilisation lysososmiale serait suivie d’une pertubation du potentiel membranaire mitochondriale après 10 heures entrainant l’activation des caspases et la fragmentation nucléaire après 24 heures (Servais et al., soumis).
Notre travail a tenté de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans l’apoptose induite par la gentamicine et plus particulièrement les rôles du lysosome et de la mitochondrie.
Dans un premier temps, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la cathepsine D et nous avons cherché à montrer par microscopie confocale et western blot, sur des cellules LLC-PK1 incubées en présence de gentamicine 2mM, une éventuelle délocalisation de cette protéase. Le western blot a permis d’observer une délocalisation de cette cathepsine de la fraction MLP vers la fraction nucléaire et le surnageant. Nous avons également testé l’effet de la pepstatine A, un inhibiteur de la cathepsine D et montré par la technique DAPI une diminution du nombre de cellules en apoptose en présence de cet inhibiteur.
Dans un second temps, nous avons tenté de mettre en évidence par western blot et par RT-PCR l’implication de la protéine Bax. Les résultats obtenus montrent qu’il y a bien une augmentation de la protéine Bax dans les cellules traitées à la gentamicine 2mM (pour des temps égaux ou supérieur à 8 heures d’incubation) mais, nous ne constatons aucune différence au niveau de l’ARNm indiquant qu’il ne s’agit pas d’une augmentation de la transcription. Enfin, par fractionnement cellulaire et western blot, nous avons cherché à montrer, comme pour la cathepsine D, des changements de localisation de la protéine Bax et du cytochrome c. Nous montrons qu’au cours de l’apoptose induite par la gentamicine, la protéine Bax est transloquée du cytosol à la mitochondrie tandis que le cytochrome c subit une translocation de la mitochondrie au cytosol.
Sur base de nos travaux, nous suggérons que l’apoptose induite par la gentamicine dans les cellules LLC-PK1 serait initiée par une perméabilisation de la membrane lysosomiale après 2 heures, entraînant un relargage de protéases lysosomiales (dont la cathepsine D) qui seraient responsables de l’activation de la mitochondrie. Au cours de cette cascade, il y aurait une activation de la protéine Bax participant à la perméabilisation mitochondriale et au relargage du cytochrome c

Gentamicins --- Cytochromes c --- Cathepsin D --- Apoptosis

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The number of cancers in the world have been increasing constantly. Therefore, the search for new treatments has intensified and has become increasingly more important. Researcher’s, are also interested in plants. The ginseng, plant with many virtues, could be counted in the treatment of cancers.In this master's thesis, we will explain how the ginsenosides, active compounds in ginseng, might exert an anticancer effect. The ginsenosides of various mechanisms of action are primarily the induction of apoptosis, the cell cycle arrest and the inhibition of angiogenesis. Ginsenosides Rh2. Rg3 and the compound K arc the major ginsenosides responsible for the anticancer effect. Then we will describe the effects that ginsenosides exert in vivo. in mice and in humans. Currently, some studies assess the anticancer effect of ginseng, but not the one from ginsenosides. In Belgium, ginseng is present in the fom1 of dietary supplements and is mostly used for i ts invigorating effect. However, natural plants could have side effects, drug interaction s and contraindications. The pharmacist remains first in line to detect these interactions. Its role is, all the more, important since dietary supplements arc often taken Over the counter. as self-medication. Le nombre de cancers dans le monde est en augmentation perpétuelle. Dès lors, la recherche de nouveaux traitements prend de plus en plus d'ampleur. Les chercheurs s'intéressent également aux plantes. Le ginseng, plante aux nombreuses vertus, pourrait être envisagé dans le traitement des cancers.Dans ce mémoire, nous allons expliquer comment les ginsénosides , composés actifs du ginseng, pourraient exercer un effet anticancéreux . Les différents mécanismes d'action des ginsénosides sont principalement 1'induction de l'apoptose, l'arrêt du cycle cellulaire et l'inhibition de l'angiogenèse. Les ginsénosides Rh2, Rg3 et le composé K sont les principaux ginsénosides responsables de l'effet anticancéreux. Ensuite, nous allons décrire les effets que les ginsénosides exercent in vivo, chez la souris et chez l'homme. Actuellement, certaines études évaluent plutôt l 'effet anticancéreux du ginseng et non des ginsénosides.En Belgique, le ginseng est présent sous forme de compléments alimentaires et est surtout utilisé pour son effet tonifiant. Toutefois, les plantes naturelles ne sont pas dénudées d'effets secondaires, d'interactions médicamenteuses et de contre-indications. Le pharmacien d'officine reste donc en premier ligne pour détecter ses interactions. Son rôle est d'autant plus important que les compléments alimentaires se prennent souvent en automédication.

Ginsenosides --- Antineoplastic Agents

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Early diagnosis of prostate cancer is becoming more and more necessary in view of the number of cases per year. For this, the metabolomics approach could become an interesting tool. It allows to develop a metabolic profile reflecting a physiological condition. Indeed, as in aech pathology, prostate cancer has an altered metabolic network. The tumor causes disturbances in concentrations of some metabolites, including those involved in cell proliferation. The study of these disturbances can then lead to a better understanding of the molecular mechanisms involved and thus indirectly to the identification of new biomarkers diagnoses, prognoses or event to see the identification of new therapeutic targets. The metabolomics approach uses a large number of analytical techniques, each with its advantages and disadvantages, thus allowing the entire metabolomics profile. Among these analytical techniques, nuclear magnetic resonance and mass spectrometry coupled to chromatography are the most employed. Using this approach seems to be very promising in the early diagnosis of prostate cancer despite some weakness in the methodology. Further studies are then still needed so that one day metabolomics may be useful in the diagnosis of prostate cancer. Le diagnostic précoce du cancer de la prostate devient de plus en plus nécessaire au vu du nombre de cas recensés par an. Pour cela, l’approche métabolomique pourrait devenir un outil intéressant. Elle permet de dresser un profil métabolique reflétant ainsi un état physiologique. En effet, comme dans chaque pathologie, le cancer du la prostate présente un réseau métabolique altéré. La tumeur entraine des perturbations au niveau des concentrations de certains métabolites, notamment ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. L’étude de ces perturbations peut alors mener à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués et donc indirectement, à l’identification de nouveaux biomarqueurs diagnostics, pronostics ou voir même à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’approche métabolomique utilise un grand nombre de techniques analytiques, présentant chacune ses avantages et inconvénients, permettant ainsi de donner tout un profil métabolomique. Parmi ces différentes techniques analytiques, la Résonance Magnétique Nucléaire et la Spectrométrie de masse couplée à la chromatographie sont les plus employés. L’utilisation de cette approche semble être très prometteuse dans le diagnostic précoce du cancer de la prostate malgré quelques faiblesses dans la méthodologie. D’autres études sont alors encore nécessaires pour qu’un jour la métabolomique puisse être totalement utile dans le diagnostic du cancer de la prostate.

Metabolomics --- Prostatic Neoplasms